Krzywa wzorcowa

Krzywa wzorcowa - Inaczej krzywa kalibracyjna. Jedna z metod kalibracji analitycznej. Graficzne przedstawienie zależności pomiędzy absorbancją i stężeniem substancji wzorcowej. Krzywą wzorcową należy przygotować kilka razy. Na przesunięcie krzywej lub zmianę kąta nachylenia mogą wpływać takie czynniki, jak: zmiana warunków pracy i zmiana temperatury. Należy za każdym razem sporządzać nową krzywą pomiaru w danym dniu pracy lub korzystać z jednej krzywej wyznaczonej na podstawie kilku pomiarów w zależności od tego, jak duże są odchylenia (M. Wasielewska, s. 5).

TL;DR

Krzywa wzorcowa to graficzne przedstawienie zależności pomiędzy absorbancją i stężeniem substancji wzorcowej. Aby ją przygotować, należy przygotować kilka roztworów wzorcowych o różnych stężeniach. Parametry krzywej wzorcowej, takie jak współczynniki a i b, mogą być wyznaczone za pomocą odpowiednich formuł w arkuszu kalkulacyjnym. Jakość krzywej wzorcowej ocenia się za pomocą odchylenia standardowego reszt i współczynnika determinacji liniowej. Zakres roboczy krzywej wzorcowej powinien uwzględniać zawartość analitu w najniższym i najwyższym wzorcu odniesienia. Kontrola użyteczności krzywej wzorcowej odbywa się za pomocą kart kontrolnych.

Roztwory wzorcowe

Aby przygotować krzywą wzorcową należy przygotować pięć, sześć roztworów wzorcowych o znanych i ściśle określonych stężeniach analitu dobranych tak, aby różniły się o około 30 procent obejmowały swym zakresem stężenia agalitów w oznaczanych roztworach. Roztwory wzorcowe można podzielić na roztwory robocze i roztwory podstawowe. Roztwory podstawowe są często najbardziej stężone. Można je przygotować w postaci roztworów wodnych, czasami z dodatkiem kwasów (jeżeli rozpuszczane substancje silnie hydrolizują). Roztwory robocze uzyskuje się odpowiednio rozcieńczając roztwory podstawowe. Najczęściej roztwory robocze są rozpuszczanie w innych rozpuszczalnikach niż woda (M. Wasielewska, s. 5).

Wyznaczanie parametrów krzywej wzorcowej

Krok 1 - Gromadzenie danych

Jeżeli krzywa wzorcowa jest przygotowywana pierwszy raz dla danego urządzenia pomiarowego, należy dowiedzieć się w ilu punktach pomiarowych konieczne jest przeprowadzenie wzorcowania oraz jaką funkcję matematyczną trzeba wybrać do opisu krzywej wzorcowej. Informacje te są zawarte w normie PN-EN ISO 6143 Analiza gazu. Metody porównawcze do określenia i sprawdzania składu gazowych mieszanin wzorcowych. Jeśli krzywa wzorcowa ma być określona funkcją liniową trzeba wykonać minimum 3 punkty kalibracyjne. Dwa punkty konieczne są do wyznaczenia równania prostej, z której można odczytać współczynniki a i b dla krzywej wzorcowej. Trzeci punkt ma za zadanie potwierdzenie liniowości układu pomiarowego na wzrastające stężenie analitu. Konieczne jest wykonanie minimum pięciu pomiarów w każdym punkcie pomiarowym, aby móc odrzucić ewentualne wyniki odstające. Ze statystycznego punktu widzenia wykonanie minimum dziesięciu pomiarów jest koniecznością.

Krok 2 - Wyznaczenie parametrów charakterystycznych dla krzywej wzorcowej

Wyznaczanie parametrów najlepiej rozpocząć od wyznaczenia współczynnika zmienności dla każdego punktu wzorcowania. Od wyżej wymienionego parametru zależy użyteczność wyznaczonej krzywej wzorcowej w pełnym zakresie pomiarowym, a także świadczy o konieczności podzielenia jej na podzakresy. Taki podział skutkuje koniecznością wykonania dodatkowych pomiarów w punkcie wzorcowania, aby były minimum trzy punkty wzorcowania w każdym podzakresie. Współczynnik zmienności to stosunek odchylenia standardowego wyników w danym punkcie wzorcowania do wartości średniej wyników w wyznaczonym punkcie wzorcowania. Aby statystycznie ocenić różnice współczynników zmienności dla wybranych punktów wzorcowania wykorzystuje się test F-Snedecora, czyli stosunek dwóch odchyleń standardowych - większe w liczniku, mniejsze w mianowniku. Jeśli porównanie trzech punktów nie wykaże statystycznych różnic należy przyjąć, że przedział roboczy krzywej wzorcowej determinowany jest przez minimalny i maksymalny punkt wzorcowania.

Krok 3 - Współczynniki a i b

Kiedy znany jest zakres roboczy krzywej wzorcowej należy przejść do wyznaczenia współczynników a i b funkcji liniowej opisującej równanie krzywej wzorcowej. Współczynnik określa wartość sygnału dla próbki ślepej. Współczynnik b charakteryzuje czułość układu pomiarowego. W celu wyznaczenia współczynników a i b w arkuszu kalkulacyjnym Microsoft Excel'. Formuły umożliwiające obliczenie współczynników to Nachylenie i Odcięta.

Krok 4 - Ocena jakości krzywej wzorcowej

Aby ocenić jakość krzywej wzorcowej, należy wyznaczyć odchylenie standardowe reszt i współczynnik determinacji liniowej.

Odchylenie standardowe reszt oblicza się w arkuszu kalkulacyjnym Microsoft Excel' za pomocą formuły REGBŁSTD. Współczynnik ten określa odchylenie między wartością empiryczną a wartością teoretyczną, czyli jaka jest różnica między teoretyczny położeniem punktów wzorcowania (określonych na podstawie parametrów krzywej wzorcowej) a faktycznym położeniem punktów określonym w trakcie pomiarów. Im ta warość jest niższa, tym lepiej dopasowana jest krzywa wzorcowa do punktów wzorcowania, Nie jest to wartość znormalizowana, co oznacza brak możliwości wykorzystania do oceny dwóch różnych krzywych wzorcowych.

Współczynnik determinacji wyznacza formuła R.KWADRAT. Jest to wartość znormalizowana oraz przyjmuje wartości od zera do jeden. Jeżeli wartość współczynnika determinacji jest bliska 1, dopasowanie krzywej do punktów empirycznych jest dobre. Ten współczynnik może służyć również do porównania dwóch krzywych.

Należy zawsze wizualnie ocenić dopasowanie krzywej do punktów wzorcowych ponieważ wskaźniki matematyczne nie zawsze są w stanie wyeliminować subtelne błędy, takie jak: dopasowanie krzywej wzorcowej opisanej funkcją liniową do punktów układających się w kształcie paraboli. Część punktów układa się nad krzywą, część układa się pod krzywą - wskaźniki matematyczne nie sygnalizują problemu, który jest możliwy do zaobserwowania empirycznie.

Krok 5 - Wyznaczenie zakresu roboczego krzywej wzorcowej

Zakres roboczy krzywej wzorcowej powinien znajdować się pomiędzy zawartością analitu w najniższym i najwyższym wzorcu odniesienia. Takie ograniczenie skutkuje pewnością dobrej odpowiedzi układu pomiarowego w badanym zakresie. Kolejnym elementem koniecznym do rozpatrzenia podczas wyznaczania zakresu roboczego jest współczynnik zmienności. Dla każdego z punktów wzorcowych w zakresie roboczym współczynnik musi być na tym samym poziomie.

Krok 6 - Kontrola użyteczności krzywej wzorcowej

Bieżąca kontrola ma zapewnić zmianę nie większą niż wynika z charakterystyki metody. W tym celu należy wykorzystać minimum trzy materiały odniesienia, które pokryją cały zakres roboczy. W celu kontroli użyteczności stosuje się karty kontrolne w których odnotowuje się między innymi przekroczenia linii kontrolnej zewnętrznie i wewnętrznie oraz układanie wyników w niekorzystny trend. Zaletą takich kart jest możliwość wykrycia przez doświadczonego analityka sytuacji potencjalnie niebezpiecznych. Dzięki nim można również oszacować zachowanie charakterystyki przez metodę pomiarową (K. Nyrek 2014 s. 24-26).

Krzywa wzorcowa — artykuły polecane

Histogram — Analiza regresji — Metody statystyczne — Próba — Wartościowanie jakości — Współczynnik determinacji — Alfa Cronbacha — Błąd względny — Analiza przyczynowa

Bibliografia

• Nyrek K. (2014) Krzywa kalibracyjna krok po kroku LAB rok 19, nr 4
• Polanowski A. (red.) (2015) Laboratorium z biochemii Uniwersytet Wrocławski
• Wasielewska M. (2008), Spektrofotometria UV/VIS, Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Katedra Analizy Środowiska

Autor: Julia Witana